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Edu Cómputo A.C., UMSNH, ANUIES y SINED (2010).MX

Mayo 19, 2010

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La muerte celular programada, o apoptosis, es un campo de investigación científica  que intenta explicar el colapso orquestado de una célula, la membrana se ulcera, la contracción del volumen de la célula, la fragmentación de la proteína, condensación de la cromatina y la degradación del ADN seguida de una rápida destrucción.

La apoptosis es una parte esencial de la vida de cualquier organismo multicelular y la forma en que la mayoría de las células mueren se conserva desde gusanos hasta los mamíferos. En un mantenimiento óptimo del cuerpo, significa que alrededor de 10 mil millones de células morirán en un día normal sólo para contrarrestar el número de nuevas células que surgen a través de la mitosis. Durante la apoptosis el ciclo de desarrollo, ayuda a la escultura del cuerpo, forma de los órganos, y tallar los dedos de manos y pies. Tanto el sistema nervioso y el sistema inmunológico surgen a través de la sobreproducción de células, seguido de la muerte de aquellas que no logran establecer conexiones sinápticas funcionales o las especificidades productivas de antígenos, respectivamente. La apoptosis es necesaria para purgar el cuerpo de gérmenes patógenos que invadió las células, pero también es necesaria para eliminar las células inmunes activadas o auto-agresivas. Tal muerte debe estar bien regulada, un desequilibrio apoptótico puede conducir a patologías como problemas de desarrollo, enfermedades autoinmunes, neurodegeneración o cáncer.

No es sorprendente entonces que la ciencia se esmere en entender cómo las células mueren, cuándo, por qué y cómo, precisamente, y para encontrar las drogas que interfieren con los pasos específicos a lo largo de la vía.

La apoptosis -la destrucción regulada de una célula- es un proceso complicado. La decisión de morir no puede tomarse a la ligera, la actividad de muchos genes influye en la probabilidad de que una célula active su programa de auto-destrucción. Una vez que se tome la decisión, la correcta ejecución del programa de apoptosis requiere la activación coordinada y ejecución de los subprogramas de muerte. Aquí debo hacer para revisar los componentes básicos de la maquinaria de muerte, describir cómo interactúan para regular la apoptosis en forma coordinada, y discutir las principales vías que se utilizan para activar la muerte celular.

Animales multicelulares a menudo necesitan deshacerse de las células que están en exceso o que son potencialmente peligrosas. Para ello, utilizan un programa activo molecular específico. Tan importante como la división celular y la migración celular, regulada (o programada) la muerte celular permite que el organismo pueda controlar estrictamente el número de células y el tamaño de los tejidos; para protegerse de células malignas que amenazan la homeostasis. La muerte celular programada fue descubierta y redescubierta en varias ocasiones por diversos biólogos del desarrollo y citotecnólogos, adquirido un número de nombres distintos en los últimos dos siglos [1] . El término apoptosis es definitivamente aprobado, acuñado por Currie y colegas en 1972 para describir un tipo de muerte celular programada que los autores observaron repetidamente en varios tejidos y tipos de células [2] . Los investigadores notaron que estas células mueren y comparten muchas características morfológicas, que eran distintas de las características observadas en las células que sufren la muerte patológica, células necróticas sugirieron que estas características morfológicas compartidas podrían ser el resultado de una muerte celular subyacente común, sostienen la presencia de un sistema de muerte celular endógeno [3] .

Las caspasas: los verdugos centrales de la mayoría de los cambios morfológicos que se observaron, son causados por un conjunto de proteasas de cisteína que se activan específicamente en las células apoptóticas. Estas proteasas de muerte son homólogas entre sí, y forman parte de una familia de proteínas conocidas caspases o caspasas [4] . Las caspasas son altamente conservadas durante la evolución, y se puede encontrar desde los humanos hasta los insectos, nemátodos e hídricos [5] ^, [6] ^, [7] . Más de una docena de caspasas se han identificado en seres humanos; cerca de dos tercios de éstas han sido sugeridas para la función en la apoptosis^7, [8] . Todas las caspasas conocidas poseen una cisteína en el sitio activo, sus sustratos se unirán en Asp-xxx (es decir, después de los residuos de ácido aspártico), la especificidad de sustrato de una caspasa distinta es determinada por los cuatro residuos amino-terminal hasta el punto de corte [9] ^, [10] . Las caspasas se han subdividido en subfamilias en función de su preferencia de sustrato, grado de identidad de la secuencia y las similitudes estructurales¹⁰. Debido a que llevan a la mayoría de los cambios visibles que caracterizan a la muerte celular por apoptosis, las caspasas pueden ser consideradas como los verdugos centrales de la ruta apoptótica. De hecho, se ha logrado que la actividad caspasa se detenga, ya sea por mutación o el uso de inhibidores farmacológicos pequeños, se ralentizará o incluso se puede prevenir la apoptosis⁷. Por lo tanto en las células, el bloqueo de caspasas puede rescatar de su destino condenado de apoptosis a la célula, un hecho que no ha escapado a la atención de la industria farmacéutica [11] .

¿Qué es exactamente lo que a las caspasas las hace tan importante para la apoptosis?

La activación de las caspasas no da lugar a la degradación de proteínas celulares al por mayor. Por el contrario, las caspasas escinden selectivamente en un conjunto limitado de proteínas blanco, por lo general a una, o a lo sumo unas cuantas posiciones en la secuencia principal (siempre después de un residuo de aspartato). Pero también pueden activar las proteínas las caspasas, ya sea directamente, por fuera cortando un dominio regulador negativo, o indirectamente, mediante la eliminación de una subunidad reguladora (ver figura 1).

Fig. 1. Mecanismo de activación caspasa.

Varios sustratos caspasa importantes se han constatado en los últimos años. Uno de los descubrimientos más interesantes ha sido la elucidación del mecanismo de activación de la nucleasa responsable de la escalera nucleosomal. Descrita por primera vez por Wyllie [12] , esta nucleasa corta el ADN genómico entre nucleosomas, para generar fragmentos de ADN con una longitud correspondiente a los números enteros múltiplo de aproximadamente 180 pares de bases. La presencia de esta escalera de ADN se ha usado ampliamente como un marcador de muerte celular por apoptosis. En una elegante serie de experimentos, los grupos de Wang y Nagata mostraron que la escalera de ADN nucleasa (ahora conocida como la caspasa activa DNase o CAD) pre-existe en las células vivas como un complejo inactivo con una subunidad inhibitoria, llamada ICAD [13] . La activación de CAD se produce por medio de la segmentación caspasa-3-mediada de la subunidad inhibitoria, lo que resulta en la liberación y activación de la subunidad catalítica [14] .

El clivaje de la caspasa-mediada de substratos específicos también explica varios de los rasgos característicos de la apoptosis. Por ejemplo, para la escisión de las láminas nucleares se requiere de la energía nuclear y la reducción segregada del citoesqueleto [15] . La pérdida de la forma de la célula generalmente es probable que sea causada por la ruptura de las proteínas del citoesqueleto como fodrina y gelsolina [16] . Por último, aparece el crucero de la caspasa-mediada PAK2, miembro de la familia de quinasas activadas por p21, parece mediar en la granulación observada en las células apoptóticas. Curiosamente, en este último caso, el crucero de la caspasa se produce entre la subunidad reguladora negativa y la subunidad catalítica, y resulta en una activación constitutiva de PAK2 [17] .

Cerca de 100 sustratos caspasa adicionales se han registrado durante los años recientes, y sin duda habrá muchos más [18] . ¿Por qué hay tantos sustratos? Tal vez la apoptosis es mucho más complicada de lo que se cree. De hecho, varios de los subprogramas claves de la apoptosis, tales como contracción de la célula y la emisión de señales a favor de inmersión, siguen siendo poco conocidos [19] . Alternativamente, es posible que muchos de los sustratos caspasa descritos no son sustratos pertinentes, sino que simplemente "inocentes" que quedan atrapados en la acción. De acuerdo con esta línea de razonamiento, podría haber pequeña selección contra la presencia de sitios fortuitos de desdoblamiento de las proteínas caspasa irrelevantes. Además podría permitir la experimentación de este problema para resolverlo.

Dada la gran importancia de las caspasas en el proceso de apoptosis, es razonable proponer una adecuada comprensión de la apoptosis, que nos obligue a entender cómo se activan las caspasas. Como es el caso de la mayoría de las proteasas, las caspasas se sintetizan como zimógenos enzimáticamente inertes. Estos zimógenos se componen de tres dominios: un prodomineo N-terminal, los dominios P20 y P10, que se encuentran en la enzima madura. En todos los casos examinados hasta ahora, la enzima madura es un heterotetrámero que contiene dos heterodímeros P20/P10 y dos sitios activos⁷. Aunque mucho se ha hecho sobre el hecho de que las caspasas activas son dímeros con dos sitios activos, no hay ninguna razón estructural obvia, ¿por qué esto debería ser así?, parece muy posible que las caspasas podrían existir como monómeros activos en las condiciones adecuadas. Tres mecanismos generales de activación de las caspasas se han identificado hasta ahora. Cada uno de ellos se describe brevemente a continuación.

El tratamiento caspasa se activa por ruptura proteolítica del zimógeno entre los dominios P20 y P10, y por lo general también entre los prodominios y el dominio P20. Sorprendentemente, todos estos lugares de corte ocurren en sitios ASP-X (el sitio candidato sustrato de la caspasa), lo que sugiere la posibilidad de activación autocatalítica⁹. De hecho, la manera más simple para activar una procaspasa es exponerla a otra molécula previamente activa. Esta estrategia de "cascada de caspasas" de activación es muy utilizada por las células para la activación de las caspasas prodominio corto, la caspasa 3, 6 y 7. Estas tres caspasas efectoras son consideradas los caballos de batalla de la familia de las caspasas, y suelen ser más abundantes y activas que sus primas prodominios largos. La cascada de las caspasas es un método útil para amplificar e integrar las señales pro-apoptóticas, pero no puede explicar cómo la caspasa de más arriba se activa. Al menos otros dos métodos se utilizan para echar a rodar la experimentación.

Inducida por la proximidad. Caspasa-8 es la caspasa iniciadora clave en la vía de los receptores de muerte [20] . Tras la unión de los receptores de muerte como CD95 (Apo-1/Fas) agregan y forman complejos de señalización de membrana (figura 2).

Fig. 2. Lectura de acción apoptótica.

Estos complejos luego de asociarse a través de proteínas adaptadoras a varias moléculas de procaspasa-8, dan como resultado una alta concentración local de zimógeno. El modelo de proximidad inducida postula que, en estas condiciones de hacinamiento, la baja actividad de la proteasa intrínseca de procaspasa-8 [21] es suficiente para permitir que las moléculas de enzima completas se agrieten y se activen entre sí (figura 1). Un mecanismo de acción similar ha sido propuesto para mediar la activación de las caspasas, incluyendo la caspasa-2 y la caspasa nematodo CED-3 [22] .

Aunque el obligado desplazamiento de zimógenos claramente es suficiente en muchos casos para activar caspasas [23] , es un tanto rudimentaria la manera de controlar el destino de una célula. Considerando que el concepto básico es probablemente correcto, los niveles adicionales de regulación sin duda deben existir in vivo para modular el proceso.

Asociación con una subunidad reguladora. El mecanismo de activación más complejo descrito hasta ahora es el utilizado por la caspasa-9. A diferencia de otras caspasas, su procesamiento proteolítico tiene sólo un efecto menor en la actividad catalítica de la enzima [24] . Más bien, el requisito clave para la activación de la caspasa-9 es su asociación con un cofactor de la proteína dedicada, Apaf-1. Apaf-1 fue identificada a través de un enfoque bioquímico, como una de las dos proteínas que se requieren para la activación de caspasa-9 (el citocromo c) [25] . Al principio se cree que sólo se requerirá de forma transitoria la activación de la caspasa-9, el complejo Apaf-1/caspase-9, ahora se piensa que representan en realidad la verdadera forma activa de la caspasa-9²⁴. Por lo tanto, debemos ver Apaf-1 no sólo como un activador de la caspasa-9, sino más bien como una subunidad reguladora esencial de una caspasa-9 holoenzima. Esta holoenzima a menudo denominada apoptosoma es un complejo muy grande que podría contener varias proteínas adicionales [26] .

En resumen, las caspasas efectoras se activan proteolíticamente por una caspasa superior, en la mayoría de los casos, mientras que caspasas iniciadoras son activadas a través de interacciones reguladas proteína-proteína. Los mecanismos moleculares reales que median la activación de la caspasa iniciadora, aún no están claros y, lo más probable, es que sea más complejo de comprender. Describimos a continuación algunos de los más comúnmente módulos de interacción encontrados.

Los ensambles sellan el destino. Cada una de las caspasas prodominio largo contiene en su prodominio un módulo de interacción proteína-proteína, que le permite unirse y asociarse con sus reguladores superiores. Caspasa 8 y 10 contienen un dominio efector-muerte (DED), mientras que la caspasa 2 y 9 contienen una activación de las caspasas y de dominio de reclutamiento (CARD). Estos dos dominios comparten una identidad de pocas secuencias, pero se pliegan en estructuras tridimensionales muy similares, que constan de seis hélices antiparalelas dispuestas en una clave Griega de reconfiguración [27] ^, [28] . Parece probable que el dominio de muerte, DED y CARD se derivan de un ancestro común de dominio²⁷. La estructura del dominio de muerte, DED y CARD se adapta perfectamente a su función. El paquete de hélices antiparalelas en un núcleo ensamblado, dejan al descubierto grandes superficies en que la evolución ha esculpido los dominios de interacción proteína-proteína. El rostro particular del módulo que se utiliza para la interacción varía mucho de una proteína a otra [29] . El trabajo hasta ahora sugiere que en el adaptador de muerte por lo general, los módulos median las interacciones intrafamiliares (es decir, dominio de muerte / la muerte de dominio, DED/DED y CARD/CARD). De hecho, los módulos de muerte del adaptador podrían actuar como plataformas de integración, la unión a varias proteínas diferentes, lo que podría modular su dimerización y activación de la caspasa ahí.

Mantén a tus amigos cerca, pero mantén a tus enemigos más cerca, es decir, interacciones proteína-proteína regulada, también son claves para la comprensión de una segunda serie de reguladores de apoptosis, la familia de Bcl-2. Esta familia se ha dividido en tres grupos, atendiendo a las similitudes estructurales y criterios funcionales. Miembros del grupo I poseen una actividad anti-apoptótica, mientras que los miembros de los grupos II y III promueven la muerte celular.

¿Cómo la familia Bcl-2 controla la muerte celular? Bcl-2 parece que pasa la mayor parte de su tiempo simplemente tratando de bloquear el próximo movimiento. Muchos miembros de esta familia pueden homodimerizar, pero lo más importante, a favor y en los miembros anti-apoptóticos es que pueden formar heterodímeros [30] . Debido a que cada miembro de Bcl-2 puede interactuar con otros miembros diferentes, un gran número de combinaciones de heterodímeros dentro de una célula es posible. En una primera aproximación, con heterodimerización simplemente, se puede considerar el resultado de la neutralización mutua de los obligados en favor de las proteínas anti-apoptóticas. Así, el problema se derrumba en la comparación de los niveles generales de pro y los miembros anti-apoptóticos de la familia: las células con más proteínas pro-muerte son sensibles a la muerte, las células con un exceso de miembros de la familia de protección suelen ser resistentes.

Pero las proteínas Bcl-2 claramente necesitan hacer más que sólo comunicar la una a la otra para que puedan influir en la muerte celular. ¿Cuál es la salida definitiva de todas estas interacciones? En el nemátodo Caenorhabditis elegans, la anti-apoptótica Bcl-2 homóloga CED-9 protege a las células de la muerte uniéndose directamente y Apaf-1 homóloga CED-4 [31] . Aunque este es un escenario atractivo, una interacción similar ha sido muy difícil,  para detectar en los mamíferos, por lo menos no bajo las condiciones evaluadas hasta el momento [32] . Más bien, la función clave de miembros de la familia Bcl-2 parece ser la de regular la liberación de factores pro-apoptóticos, en particular, el citocromo c, desde el compartimiento de intermembrana mitocondrial hasta el citosol³⁰.

Las mitocondrias - el foro de la muerte-. La mitocondria no sólo da poder a la célula, es también su arsenal. Las mitocondrias poseen un potente coctel de proteínas pro-apoptóticas. El más destacado de ellos es el citocromo c, el transportador de electrones. Los trabajos en los últimos años ha revelado que el citocromo c está lejos de ser inocuo, además de su participación en la fosforilación oxidativa mitocondrial, la proteína es uno de los componentes (además de la proteína adaptadora Apaf-1) para realizar la activación de la caspasa-9 en el citosol²⁵.

Exactamente cómo citocromo c gestiona el cruce de la membrana externa mitocondrial no se conoce todavía, pero está claro que la familia Bcl-2 está íntimamente involucrada en la regulación de este proceso. Por ejemplo, la adición de pro-apoptóticas Bcl-2 de las mitocondrias aisladas, es suficiente para inducir la liberación de citocromo c, mientras que la sobreexpresión de Bcl-2 la evitará [33] .

¿Cómo Bcl-2 regula la salida de citocromo c? Citocromo c de salida es una característica casi universal de la muerte celular por apoptosis. Sin embargo, en algunos casos, es un evento muy tardío. Por ejemplo, la apoptosis inducida por receptores de muerte a menudo no pasa por la vía mitocondrial [34] . Como era de esperar, este tipo de muertes son relativamente insensibles a la protección de Bcl-2 y a la liberación de citocromo c en el citosol, es probable que sea el resultado de la activación de las caspasas, en vez de su causa.

Antídotos apoptóticos y los anti-antídotos. ¿Es la liberación de factores pro-muerte de las mitocondrias en realidad el punto de no retorno? Varias líneas de evidencia sugieren que las células de vez en cuando todavía pueden ser rescatadas en este punto, por lo menos por un tiempo. En primer lugar, los inhibidores farmacológicos de las caspasas a menudo (pero no siempre) rescatan las células de la apoptosis [35] . En segundo lugar, la caspasa-3 y caspasa-9 en ratones muestran una reducción de la apoptosis neuronal durante el desarrollo y una indiferencia importante en la apoptosis [36] . En tercer lugar, los mamíferos (así como la mosca de la fruta Drosophila y algunos virus) llevan una familia de genes que codifican potentes inhibidores caspasa, conocidos como los inhibidores de la apoptosis-(IAP) [37] . No habría ninguna razón para la existencia de estas proteínas, si no podían influir en el proceso de apoptosis. Sobre la base de lo anterior, podría parecer que las células sufren de un caso terminal de indecisión a la hora de la muerte celular por apoptosis, dejando la señalización apoptótica por senderos interminables. Pero esta impresión es errónea. De hecho, muy por el contrario, la vía apoptótica contiene una serie de pasos de amplificación y bucles de retroalimentación positiva que aseguran que una célula o bien se comprometa plenamente con la muerte o se abstenga de ella por completo. Por ejemplo, el hecho de que son sustratos de procaspasas los que aseguran la conversión rápida y completa de un grupo de proenzimas, aunque sólo unas pocas moléculas se activa inicialmente⁸. Del mismo modo, es probable que la retroalimentación positiva sea entre la activación de la caspasa y la salida de citocromo c desde la mitocondria [38] .

Pero para los bucles de retroalimentación positiva, se requiere la presencia de topes y/o amortiguadores, o incluso la más pequeña perturbación que finalmente conduciría a la plena activación y la muerte por apoptosis de la célula. Las proteínas IAP bien podrían actuar como amortiguadores de tal manera. Es posible, por ejemplo, que los IAP no sean para proteger a las células de los ataques suicidas frontales, sino más bien para aplastar a la activación de la caspasa espurio espontánea. Esta idea se ve reforzada por la reciente identificación de un inhibidor de la IAP en mamíferos, conocido como Smac o DIABLO [39] . Smac/DIABLO se une a los miembros de la familia IAP neutralizando su actividad anti-apoptótica. Lo más interesante de Smac/DIABLO es que normalmente es una proteína mitocondrial, pero es liberada en el citosol de las células inducidas a morir, probablemente siguiendo la misma ruta de salida del citocromo c.

¿La activación de la caspasa, es característica definitoria de la muerte celular por apoptosis? Como mencionamos al comienzo de esta revisión tutorial, la mayoría de las características morfológicas se utilizan para describir inicialmente la muerte celular apoptótica, es la caspasa-dependiente. Pero el programa apoptótico es mucho más que las caspasas, y en muchos tipos de células, la activación del programa apoptótico conduce inevitablemente a la muerte, con o sin caspasas [40] . Lo ideal sería que nuestra clasificación definitiva de la muerte estuviera determinada no por la morfología, sino por lo que se activa en las vías moleculares en la célula que muere. Para ello será necesario el desarrollo de cada vez más ensayos sofisticados para identificar proteínas apoptóticas.

El campo de la investigación de la apoptosis si bien, se ha ampliado como resultado de las cuidadosas observaciones y deducciones astutas de un grupo de patólogos dedicados. Como dijo Yogi Berra, "Usted puede observar mucho observando lo observable". Aunque muchas de las proteínas apoptóticas clave se han identificado, aun en su mayoría están en la oscuridad, como los mecanismos moleculares de la acción o la activación de estas proteínas.

Mientras que los filósofos buscan el significado de la vida, se observa que los biólogos celulares cada vez más están interesados en el significado de la muerte. Apoptosis, la marca celular no deseada de señales del reconocimiento directo, inmersión y la degradación por los fagocitos. Lejos de ser el final de la historia, estos eventos permiten que las células en liquidación puedan conferir sentido a la muerte celular. Pero si la fagocitosis "spin doctors” recibe o transmite mensajes equivocados, surge un serio problema [41] .

El daño en el ADN con frecuencia desencadena la muerte por apoptosis. La decisión irreversible de morir puede ser facilitada o anticipada mediante la integración de una amplia variedad de estímulos dentro y alrededor de la célula. Aquí abordamos algunas cuestiones fundamentales que surgen de este modelo. ¿Por qué el daño del ADN inicia la apoptosis, en primer lugar en las células dañadas, ¿cuáles son las alternativas a la muerte y por qué deben ser seleccionadas en algunas circunstancias pero no en otras? ¿Qué señales de registro de daños en el ADN y cómo inciden en las vías efectoras de la apoptosis? ¿Existe un complejo suborganelo apoptosoma para lograr la integración de las señales de la muerte dentro del núcleo, así como lo hay en el citoplasma? y ¿cuáles son las consecuencias del fracaso para iniciar la apoptosis en respuesta al daño del ADN?

Con pocas excepciones conocidas, el programa que detiene la apoptosis de las células de los mamíferos depende de la activación de las caspasas intracelulares y su modificación de sustratos proteicos en el núcleo y el citoplasma. Dos procesos se encuentran justo a la entrada de estos eventos efectores. La primera es la activación de las vías de señalización mediada por receptores de muerte, que en última instancia de activación es por caspasa-8 y se ponen de manifiesto por la interacción de CD95 (Apo-1/Fas). La segunda se origina en las mitocondrias, que son un objetivo central para el estrés oxidativo intracelular. Hicimos hincapié en las mitocondrias de liberación de un conjunto de moléculas (citocromo c, Apaf-1 y factor de iniciación de la apoptosis), dos de los cuales contribuyen a un clúster de suborganelo molecular llamada apoptosoma, que es el responsable de la activación de la caspasa-9 [42] . Esta vía puede ser profundamente influenciada por los dos miembros pro-apoptóticos y anti-apoptóticos de la familia Bcl-2, que a su vez se modifican en respuesta a factores de supervivencia local, por fosfoinosítidos quinasa-3 (PI(3)K) y Akt [43] ^, [44] ^, [45] .

Fig. 3. Apoptosis vía PI3K y Akt.

Nos referimos a la relación entre el daño del ADN y del programa terminal de apoptosis. Debido a sus funciones normales de la demanda estructural y la integridad de secuencia durante cientos de millones de pares de bases no redundante, el genoma de los mamíferos presenta un objetivo enorme de agentes genotóxicos. Por otra parte, el ADN es altamente reactivo y es fácilmente alterado por los procesos celulares, como la oxidación. Una estimación es que uno se somete a cerca de 100,000 modificaciones del genoma por día, cada una con una probabilidad finita de daños en los residuos [46] . Las proteínas de la cromatina en la cual el ADN se inserta podrían ofrecer cierta protección frente a daños, así como prestar poderosos mecanismos de reparación existentes para restablecer la estructura del ADN y la secuencia de daños una vez producido. Sin embargo, los procesos vitales de la replicación, transcripción e incluso la propia reparación requiere el reordenamiento de la cromatina, lo que implica períodos durante los cuales podría ser vulnerable el ADN. La apoptosis es numéricamente importante como un resultado posible de daño en el ADN. ¿Por qué es necesario para las células adoptar esta estrategia, aparentemente inútil junto a la reparación?

¿Por qué debería iniciar la apoptosis cuando hay daño en el ADN?

Las células son muy diferentes en sus respuestas al ADN dañado [47] . Esto enfatiza que la apoptosis no es una consecuencia inevitable de daño en el ADN. Así que ¿por qué deberían ser?

Aunque la apoptosis está uniformemente presente en metazoos, tanto como en un programa de desarrollo y en algunos casos como una respuesta a la lesión, todavía hay controversia sobre su existencia en organismos unicelulares [48] . Ciertamente, el genoma de la levadura no codifica una proteína que, en metazoos, tiene la capacidad de transducir los estímulos del ADN dañado en el programa de apoptosis con gran eficiencia: p53 [49] . Incluso en los mamíferos p53 se activa con frecuencia por una lesión del ADN para servir a fines distintos de la apertura de apoptosis⁴⁷. Esto plantea la posibilidad de que el acoplamiento de daño en el ADN y la apoptosis pueden ser una estrategia, una adaptación de las respuestas a otras lesiones, para hacer frente a ciertos problemas de organización del tejido metazoos, depende absolutamente de la capacidad de sus células constitutivas de relacionarse entre sí. A través de la célula-célula y célula-matriz de comunicación, las funciones de reproducción, la diferenciación y el movimiento son preparados y limitados topológicamente. Algunos de estos procesos son difíciles de revertir o corregir en caso de fracaso, pero el fracaso nunca está lejos. Una dosis media de un sólo gen APC, que codifica la proteína oncosuppressor Poliposis Adenomatosa del Colon hace que el epitelio intestinal sea susceptible al desarrollo de las células con la percepción inexacta de la polaridad y la posición, y la pérdida de retención en la replicación: las células fundadoras de adenomas [50] . Es posible para las células en los tejidos metazoos salvaguardar todas las transiciones de fase importante de su vida útil contra las lesiones inducidas por errores genéticos mediante su vinculación condicionalmente a un programa de muerte, en la escultura de órganos durante el desarrollo.

Modos de morir que son menos activos que la apoptosis, son intolerablemente perjudiciales para la organización del tejido. Por otra parte, la presencia de ADN libre que termina en una célula que mantiene una capacidad de reparación del ADN, conduce a la activación de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y como consecuencia el agotamiento de la energía celular [51] . Los grupos resultantes de las células muertas, distorsionarían la ruta crítica de células en curso y célula-matriz de señalización de un tejido metazoos. Por el contrario, la apoptosis está diseñada para eliminar las células de los tejidos rápidamente, marcándolas para la fagocitosis y el reciclaje de sus moléculas constitutivas, mientras que claramente retrasan el agotamiento de la energía por desacoplamiento (a través de la activación de la caspasa) de los dominios catalíticos y de unión al ADN de la PARP. Por implicación, el umbral para la activación de la apoptosis en respuesta al daño del ADN se puede establecer: las células madre del tejido y de sus hijas que pueden tener daños se eliminan por apoptosis en respuesta a estímulos con daños menos severos que los necesarios para matar a otros miembros del mismo linaje, si es que el daño es intrínsecamente letal para estas células [52] . El gen segador de Drosophila es un buen ejemplo de configuración de umbral: en su ausencia, la resistencia de los embriones de Drosophila a la muerte celular después de la radiación ionizante es mayor, cerca de 1,000 veces [53] . De hecho, la tendencia general al suicidio de las células madre heridas es un testimonio de las medidas extremas adoptadas para contrarrestar la amenaza planteada por los progenitores que podrían haber adquirido un genoma defectuoso. El incumplimiento de iniciar la apoptosis en respuesta a lesiones del ADN de varios tipos se asocia con la aparición de células con una prevalencia a la mutación de uno o dos órdenes de magnitud por encima del objetivo de fondo [54] . ¿Cómo, entonces, el daño de ADN se identifica y se relaciona con el programa de apoptosis?

Anatomía molecular de una respuesta al ADN dañado.

La estrategia para hacer frente a el ADN dañado en eucariotes se puede dividir en tres componentes: el reconocimiento del ADN dañado, un período de evaluación de daños (impuesto por los puestos de control), y la aplicación de la respuesta apropiada (reparación del ADN o la muerte celular). Estos procedimientos no se activan de forma lineal simple, porque el reconocimiento de daños provoca múltiples señales sincrónicas que pueden desencadenarse tanto en la reparación o en los procesos apoptóticos. Los puestos de control tienen un papel fundamental en el sistema de respuesta al daño, ya que proporcionan la oportunidad de comprobar la adecuación del suicidio sobre la reparación. Los puestos de control establecen relaciones entre los procesos celulares de modo que la ejecución de un proceso depende de la finalización con éxito de una actividad anterior no relacionada [55] . El puesto de control para supervisar la replicación exacta del genoma antes de permitir la división celular es un ejemplo. En el contexto de los daños del ADN, los puestos de control son barreras para evitar la perpetuación de los genomas dañados. Estos pueden ser levantados una vez recuperado el genoma. De vez en cuando, las mutaciones afectan a los genes de los puestos de control, la consecuente es la pérdida de control de calidad sincrónica que puede tener resultados desastrosos, como se ve en los genomas desestabilizados que son característicos del cáncer [56] . La existencia de múltiples puntos de contacto entre el puesto de control y el de los programas de apoptosis podría explicar la heterogeneidad de los acontecimientos posteriores en la respuesta al daño del ADN. Estas señales mixtas podrían obligar a una célula a morir incluso cuando las máquinas de reparación del ADN han sido exitosamente desplegadas [57] .

Fig. 4. Vías apoptosis o de supervivencia.

La figura 4 muestra las opciones de reparación de ADN, importantes en una célula de mamífero. En algunos casos, grandes complejos de proteínas deben reunirse de forma secuencial sobre la lesión. Esto plantea la cuestión crítica de cómo los detectores de daño en el ADN deben ser distribuidos de una manera que les permita examinar el genoma completo. Aunque los sitios "activos de reparación” por escisión de nucleótidos (NER) repairosoma sí pueden atar a los complejos que, naturalmente, navegan por los hilos de ADN, no todos los procesos de reparación están ligados a la transcripción o replicación. Una solución sería acorralar a las proteínas de reparación en varios focos principales para la liberación en condiciones de estrés genotóxico. Un ejemplo de esto en los eucariotas simples es la descarga de una proteína de reparación de daños y modificadores de la cromatina de los telómeros de levadura después del tratamiento genotóxico [58] . Los telómeros son secuencias repetitivas de ADN protegidos por la cromatina densamente compacta y son sitios particularmente adecuados para la detección y secuestro de proteínas de reparación. Atada a los complejos del poro nuclear, los telómeros de levadura mantienen un grupo de proteínas de reparación justo debajo de la membrana nuclear [59] . Un flujo de los daños inducidos por proteínas de reparación de los mismos podría incluso proporcionar un indicador útil para la gravedad de una lesión en el ADN en particular.

En una sorprendente correlación, los componentes proteicos de los telómeros mamíferos también incluyen proteínas de reparación del ADN [60] . Una explicación de la tendencia unificadora de las proteínas de reparación para atracar en los telómeros podría ser que ellos son los extremos del cromosoma como un corte de doble cadena (DSB), si bien en una forma natural [61] . Otros, de origen natural «benigno» DSBs utilizan proteínas de reparación del ADN para los procesos tales como el gen inmunológico V(D)J [62] . Del mismo modo, la acumulación de proteínas de reparación en los telómeros podría representar un mecanismo para optimizar el mantenimiento sagaz telomérico. Como los telómeros se acortan con la edad, la exposición posterior de los extremos de los cromosomas puede desencadenar ligaduras de extremo a extremo, que es un resultado catastrófico para la célula y su descendencia. Un puesto de control para las fuerzas de células envejecidas o que sufren apoptosis cuando los telómeros son muy escasos, son necesarios para evitar la muerte [63] . Un activador del puesto de control sensible a la presencia de ADN de doble cadena sin fin, es la ATM (ataxia telangiectasia mutada, http://ghr.nlm.nih.gov/gene/ATM ) [64] .

La familia de sensores ATM del ADN dañado.

ATM es una familia de un notable grupo de PI(3)K-quinasas relacionadas que también incluye el ADN PKcs (la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN) [65] ^, [66] y ATR (ataxia telangiectasia Rad3 relacionados) [67] . Estas proteínas son cruciales para detectar el tipo más letal de los daños en el ADN, el DSB. ATM codifica una proteína con una masa molecular relativa de 350 000 (mr 350K) que contiene un dominio de unión al ADN y el dominio catalítico PI(3)K. La micrografía de fuerza atómica proporciona pruebas convincentes de que están ATM y DNA-PK unidos directamente al ADN en sus extremos libres (ver fig. 5) [68] .

Fig. 5 Análisis de ATM.⁶⁸

Habiendo hecho esto, estas quinasas catalizan cascadas de fosforilación para transmitir señales de daños a los puestos de control y las proteínas de reparación. Con la cinética de su caso, como cascadas pueden funcionar como interruptores moleculares sensibles [69] . Explorando esta cuestión, se prevé que la inestabilidad en los ciclos de fosforilación-desfosforilación podría proporcionar el mecanismo básico de un puesto de control G2/M [70] . El atractivo de este modelo es su capacidad inherente para ratificar cada componente del sistema antes de continuar, uno de los principios centrales del punto de control. En una estimación sorprendente para la sensibilidad de estos sistemas de detección de daños, se ha calculado que un solo DSB puede provocar la detención del ciclo celular [71] . Pero ¿por qué son tan grandes las quinasas, cada una con una Mr> 250 K, necesaria para detectar daños en el ADN? Una posibilidad es que estas proteínas podrían proporcionar una plataforma sobre la que otros detectores de proteínas de reparación y montaje pueden actuar.

ATM, ATR y DNA-PK actúan como sensores de puesto de control de la señal al tanto del ciclo celular y la maquinaria de apoptosis. Sin embargo, a pesar de identificar las proteínas implicadas en el reconocimiento inicial y la reparación de daños en el ADN, los medios por los cuales se induce la apoptosis de los eventos terminales no están todavía claros.

Señales de p53 para vías efectoras de apoptosis. p53 proporciona un buen ejemplo de cómo se trabajó la decisión entre la apoptosis y otros destinos que pueden hacer los puntos de control activados por el daño del ADN [72] . El punto de control de activación, con la participación de ATM y otras moléculas de reconocimiento, lleva a la fosforilación de p53, lo que altera su conformación y aumenta su estabilidad. Varios amino-terminal serinas son consistentemente fosforiladas después de la radiación inducida por daño en el ADN, y hay una cierta especificidad del mecanismo. Por ejemplo, la fosforilación de la ATM ocurre preferentemente en la Ser 15, mientras que la ADN-PK modifica Ser 15 y Ser 392 [73] ^, [74] .

Para la mayoría de las poblaciones de células de replicación, aumentan los niveles de p53 a pocos minutos del daño en el ADN y los eventos apoptóticos ocurren dentro de unas horas. Ninguna muerte temprana es vista dentro de los tejidos de ingeniería que no tiene p53 [75] . ¿Cómo, entonces, la activación de p53 por daño en el ADN conduce a la iniciación de la apoptosis? Varios reguladores del ciclo celular son inducidos por p53, por ejemplo de p21, GADD45. Otras proteínas inducidas incluyen Bax, CD95, DR5 (un receptor para el ligando TRAIL muerte) [76] . Sin embargo, la importancia de estas inducciones sigue siendo un tanto opacas, ya que algunas células de Bax^-/- y florines (CD95-inactivo) en ratones muestran sensibilidad a la radiación normal [77] . Por otra parte, la inducción CD95 depende de un elemento de respuesta de p53 en el primer intrón que se activa por igual por p53 de tipo silvestre y mutantes puntuales que están inactivos en el inicio de la apoptosis [78] . Una proteína más importante que p53 inducida es MDM2 [79] . Esta escolta a p53 en el núcleo y para los objetivos de la degradación de proteasoma, garantizan así que la señal de p53 es transitoria y la controla cuidadosamente.

E2F-1 activo y la apoptosis. El segundo candidato que une el daño del ADN a la apoptosis es el factor de transcripción E2F-1. Esta proteína se libera del Rb, cuando está fosforilado durante la progresión del ciclo celular a través de G1. Concomitante con la inducción de los genes precoces inmediatos de la replicación del ADN (incluyendo, c-myc), E2F-1 con DP-1 [80] . Ahora se sabe que tanto E2F-1 y p53 se encuentran dentro de una vía de daños en el ADN [81] y se estabilizan después de la exposición a las radiaciones ionizantes o radiación ultravioleta C. Al igual que p53, E2F-1 se une y se inactiva por hDM2 (la versión humana de MDM2), al mismo tiempo la liberación de DP-1 al núcleo. Por otra parte, la expresión de E2F-1 puede iniciar la apoptosis, incluso en un contexto de p53-nulo. Por lo tanto, hDM2 puede actuar como un factor de supervivencia, independientemente de su interacción con p53, a través de su capacidad para unirse y desestabilizar E2F-1. En un nuevo desarrollo, se identificó dos grupos E2F-1 y p73 en una vía de apoptosis, proporcionando un mecanismo por el asesinato E2F-1-mediado que puede ocurrir en ausencia de p53 [82] ^, [83] .

c-Abl activo y apoptosis. Un tercio de la fosforilación del sustrato de ATM después de la lesión del ADN es la proto-oncoproteína c-Abl. c-Abl es una tirosina quinasa Src con un dominio inusual carboxi-terminal que contiene señales de localización nuclear y la unión a los sitios ADN [84] . De acuerdo con su distribución tanto en el núcleo y el citoplasma, los datos sugieren que la inmunoprecipitación une DNA-PK, ATM, Rad51, Rb, p53 y p73 [85] . Después del daño al ADN por la radiación ionizante, c-Abl se activa por fosforilación a través de un mecanismo dependiente de la ATM para aumentar su actividad quinasa. DNA-PK también fosforila c-Abl, que a su vez fosforila ADN PKcs en un mecanismo de retroalimentación que hace que se disocie de la Ku [86] . Aunque c-Abl es conocido por ser un sustrato ATM y puede interactuar con muchas de las nucleoproteínas relacionadas con la respuesta celular al daño del ADN, el significado de la mayoría de sus reacciones no está claro⁸⁹.

Se plantea la cuestión de por qué las señales del daño de ADN para la maquinaria de apoptosis necesitan ser tan redundantes y complejas. Una posible respuesta se deriva de la observación de que muchas de las señales que favorecer la muerte pueden ser anuladas. Presumiblemente los muchos estímulos que llegan a la célula lesionada definen un umbral para la apoptosis, que puede variar con el tiempo. La decisión final para iniciar la apoptosis en lugar de la detención del ciclo celular o la falta de respuesta por cualquiera de las rutas es probable que sea condicionada por la magnitud y duración del estímulo de daño. Asimismo, reflejan el estado de replicación de la célula dañada, su historia reciente, como lo demuestra la disponibilidad de MDM2 o CD95, e incluso su posición, porque el entorno del factor de crecimiento local expresa la proximidad a las células vecinas y la membrana basal [87] ^, [88] .

El apoptosoma nuclear. Jeffrey Nickerson en 1998 comentó: "Hay, sin embargo, dos propiedades de los tumores que son fundamentales y que definen algunos tumores como malignos. Estos son, en primer lugar, las alteraciones en la arquitectura de las células y tejidos y, en segundo lugar, la inestabilidad genética. Ambos de estos sellos del cáncer pueden abordarse mediante el examen de la estructura nuclear." [89] De hecho, parece que ambos están íntimamente conectados, sistemas de reparación tienen que lidiar con la topología compleja del ADN, probablemente por su anclaje a la matriz nuclear. Además, para enormes complejos nucleares se sabe la coreografía de múltiples funciones nucleares. De hecho, se está acumulando evidencia de que el núcleo es una masa creciente de estos super complejos, varios de los cuales están fuertemente implicados en la apoptosis y la reparación del ADN [90] . Una de ellas es el cuerpo PML, que toma su nombre del cáncer (leucemia promielocítica) que interrumpe su estructura [91] . PML adquiere un gran número de nucleoproteínas, crucial para casi toda la gama de funciones nucleares y las almacena en los órganos de la PML. El modo de esta asociación es en gran parte desconocido, aunque la modificación introducida por el modificador de la ubiquitina-relacionados (SUMO-1) parece ser un mecanismo [92] . PML también puede actuar en concierto con DAXX (un represor transcripcional) para potenciar apoptosis [93] , una teoría apoyada por la resistencia observada en los sistemas de PML-deficiente a partir de múltiples estímulos de apoptosis [94] .

Apoptosis en el sistema inmune es un proceso fundamental que regula la maduración de linfocitos, la selección de repertorio de receptores y la homeostasis. Por lo tanto, la muerte por apoptosis es tan esencial para la función de los linfocitos como el crecimiento y diferenciación. Nos centramos en la apoptosis que involucra los receptores de muerte asociados y el papel de CD95 (Apo-1/Fas) en la señalización mediada por células T y el desarrollo de células B y en el transcurso de una respuesta inmune. Obtener una visión de estos procesos mejora nuestra comprensión de la patogénesis de enfermedades como el cáncer, la autoinmunidad y el SIDA; sobre todo nuevos enfoques médicos de las estrategias de tratamiento racional.

El sistema inmune es una sociedad de interacción que consiste en células T y los linfocitos B, células NK o “asesinas natural”, macrófagos y especializadas presentadoras de antígeno (APC) y sus diferentes subclases. La mayoría de los componentes celulares del sistema inmune nacen en la médula ósea. Linfocitos B, células NK y los macrófagos maduran en la médula ósea y en el hígado fetal. Linfocitos T maduran en la médula ósea y en el timo. Células T y células B comparten muchas características de desarrollo, pero están inmersas en la apoptosis [95] .

Las células B. Las células B expresan receptores de la membrana celular (anticuerpos) con una especificidad de antígeno único. Millones de diferentes células B producen anticuerpos y pueden captar a millones de antígenos. La suma de todas las especificidades del anticuerpo se llama «el repertorio de anticuerpos [96] . Las células B son seleccionadas en la médula ósea sobre la base de la afinidad de sus anticuerpos: Las células con alta afinidad por proteínas derivadas de "yo" se eliminan en los tejidos. Linfocitos B maduros salen de la médula ósea y poblan los órganos linfoides secundarios, el bazo y los ganglios linfáticos y el tejido linfoide asociado al intestino. Una vez activadas por un antígeno, las células B someten a una segunda ronda de selección en los folículos de los órganos linfoides secundarios, tras lo cual se maduran en células plasmáticas que producen y secretan anticuerpos antígeno-específicos, y luego recircular a la médula ósea [97] .

Las células T

Linfocitos pre-T emigran de la médula ósea al timo. En el timo, maduran y son seleccionados positivamente o negativamente, dependiendo de la afinidad de sus receptores de antígeno de células T (TCR) para la mayor histocompatibilidad (MHC) de antígenos. MHC de clase I y II antígenos son moléculas que muestran fragmentos del péptido de proteínas extrañas. Muestran estos péptidos en la superficie de la célula para su examen por las células T - un proceso llamado "la presentación de antígenos. Cada MHC de clase I o II presenta un fragmento diferente; miles de moléculas de MHC sobresalen de cada célula. La mayoría de los péptidos presentados en el timo se derivan de proteínas propias. Las células T con una alta afinidad por moléculas de MHC y el péptido se eliminan para garantizar la tolerancia a los tejidos normales y prevenir la autoinmunidad. Las células T que interactúan con las moléculas MHC de clase II se convierten en células que expresa la molécula CD4 en su superficie (CD4⁺), y los que tienen afinidad por las moléculas MHC de clase I se convierten en linfocitos T que llevan el antígeno CD8 (CD8⁺). Sólo las células T maduras que producen un TCR funcional abandonan el timo y se corren en los órganos linfoides secundarios. Parejas de células T CD4⁺ funcionan como células T cooperadoras y secretan citoquinas que regulan tanto las respuestas inmune celular o las respuestas de anticuerpos. Parejas de células T CD8⁺ citotóxicos tienen función  efectora (asesina) de las células [98] .

Vida y muerte en el sistema inmune

Varias características del sistema inmune son únicas. Una de ellas es su especificidad: el repertorio de linfocitos T y B, inicialmente construido a partir de anticuerpos seleccionados al azar y los genes TCR región variable, es formado por selección para hacer frente, por una parte, con el vasto universo de antígenos y, por otra parte, con el peligro de la autoinmunidad⁹⁸. Otra característica distintiva es su control homeostático: después de una fase de expansión clonal, los linfocitos reaccionan con el antígeno, debe ser valorada de nuevo hasta que guerra de células linfoides alcanza el nivel básico de nuevo [99] . Esto se logra por el equilibrio de ajuste entre el crecimiento o la expansión y la muerte por apoptosis, en general, el sistema inmune produce más células de lo que es necesario, y las células extra se eliminan por apoptosis.

Apoptosis es la forma más común de muerte en las células del sistema inmune. Es sorprendente cómo muchas vías celulares diferentes del sistema inmune pueden elegir morir. En principio, la muerte puede ser por errores cuando los receptores específicos de antígeno de las células linfoides no se estimulan o se ven privados de citocinas tróficas. En una forma más activa, la muerte puede afectar los sistemas muerte-receptor [100] . La apoptosis es una característica central de regulación del sistema inmunológico que no es de extrañar que muy poco o demasiado los resultados de la apoptosis se relacionen con enfermedades graves.

El sistema de muerte CD95-CD95L

Un subconjunto de receptores de factor de necrosis tumoral (TNF-R), está involucrado en la muerte de transducción de señales, por lo que se refiere como "receptores de muerte”. Los miembros de esta familia contienen desde una hasta cinco repeticiones ricas en cisteína en su dominio extracelular y un dominio de muerte en su cola citoplasmática. El dominio de muerte es esencial para la transducción de la señal de apoptosis. CD95 es un miembro de la familia tal que tiene un papel importante en el sistema inmune. Es una molécula glicosilada ampliamente expresada en la superficie celular en una masa molecular relativa 45,000-52,000 (335 residuos de aminoácidos). Es un tipo transmembrana receptor, puede parecer en una forma soluble, cuya función es muy clara [101] . La expresión de CD95 puede ser impulsada por las citocinas como el interferón y TNF, también por la activación de los linfocitos [102] ^, [103] .  La apoptosis mediada por CD95 está condicionada por su ligando natural, CD95L,  es un TNF-relacionado tipo II transmembrana molecular [104] y se expresa en una forma mucho más restringida que la del receptor. Las células asesinas (linfocitos citotóxicos T) eliminan, por ejemplo, las células infectadas por virus y las que expresan CD95L pueden hacerlo mediante la interacción con el receptor CD95 [105] ^, [106] .

Fig. 6. linfocitos citotóxicos T y CD95.

CD95L se observa desde hace años como la causa de muerte derivada de la célula vesícula [107] , pero también puede ser escindida de la membrana por una metaloproteasa [108] , mientras que CD95L humano soluble puede inducir apoptosis [109] , y la versión soluble en ratón CD95L no puede [110] .

El CD95 induce la muerte por señalización.

La oligomerización, muy probablemente la trimerización de CD95 es necesaria para la transducción de la señal de apoptosis. Un complejo de proteínas asociadas con CD95 activa [111] . Esta muerte que induce el complejo de señalización (DISC) se forma en cuestión de segundos con la participación de los receptores [112] . En primer lugar, el adaptador FADD (proteína de la muerte de dominio asociado a Fas, también conocido como Mort1) se une a través de su propia muerte de dominio al dominio de muerte en CD95 [113] . FADD también lleva a un dominio de muerte-efectora llamado (DED), y a través de la interacción homóloga, los reclutas del DED que contienen procaspasa-8 (también conocido como FLICE). A continuación, la procaspasa-8 se activa y activa la caspasa proteolíticamente 8- se libera en el citoplasma en forma de un heterotetrámero de dos subunidades pequeñas y dos grandes [114] . Activa caspasa-8 se unirá a varias proteínas en la célula como la procaspasa-3, que da lugar a su activación y la realización del programa de muerte celular. Varias otras proteínas han sido descritas para unirse a CD95 activado, pero su papel exacto e importancia en la regulación de la apoptosis queda por definirse [115] .

Recientemente, con el uso de la transferencia de energía de la fluorescencia de resonancia, otro modelo de señalización de CD95 se ha elaborado. En dominios extracelular de concentración antes del ligando (PLADs) fueron descritos por CD95 y TNF-R, que se supone a los receptores antes de la unión del ligando. Para evitar que la señalización de los receptores pre asociados se unan, es una situación peligrosa, los bloqueadores de la apoptosis intracelular asociados al receptor se postularon [116] ^, [117] . Sobre la base del modelo PLAD no está del todo claro cómo la unión del ligando interfiere con la asociación PLAD y conduce a la asociación de los receptores, que inicia la apoptosis. Un trabajo más estructural es necesario para resolver estos problemas. Tampoco está claro si el modelo DISC y el modelo PLAD se complementan entre sí para describir inicial eventos de señalización in vivo.

Considerando que algunos linfocitos T citotóxicos matan a sus células mediante la activación de los receptores de muerte, otros utilizan la perforina y granzima B (GRB) para eliminar las células infectadas. Con la ayuda de perforina, GrB encuentra su camino en la celda de destino y puede matar directamente cortando y activando la caspasa-8 [118] (Fig. 6).

La muerte de los linfocitos T en el timo.

El repertorio de células T se forma en el timo por apoptosis y las señales de supervivencia. Un ratón adulto joven con (1-2)x10⁸  timocitos genera entre 20 y 40 millones de células T nuevas por día [119] . Pero el número de células T que salen del timo y entran en el torrente de células T periféricas es de sólo 2-3% de la cantidad inicialmente generada. A pesar de la alta tasa de mortalidad de las células T en el timo, sólo un número limitado de células apoptóticas se puede observar en cortes histológicos. Por lo tanto, los timocitos apoptóticos se eliminan de manera eficiente y, lo más importante, esto se logra sin signos de inflamación [120] .

Linfocitos pre-T, tras la entrada en el timo, diferencian y reordenar sus genes TCR. Esas células T que no reordenar sus genes TCR por lo tanto no pueden ser estimuladas por los complejos auto-MHC-péptido que mueren por descuido. En los linfocitos T de ratones transgénicos FADD dominante-negativa la exigencia de señales pre-TCR se pasa por alto [121] . En estos ratones, la supervivencia de las células T y la diferenciación se promueven, debido a que es un adaptador FADD esencial de varios discos de los receptores de muerte, estos datos sugieren un papel de receptores de muerte en esta etapa temprana del desarrollo de células T. Timocitos que hayan superado la selección pre-TCR más madura, se desarrollan en células CD4⁺ y CD8⁺ (dobles positivas) a las células T y se someterán a la selección positiva y negativa de afinidad TCR que circulan por las células del estroma del timo. Después de estos procesos de selección, sólo para adultos positivos CD4⁺ MHC de clase II-restringida y CD8⁺ MHC de clase I restringida célula T, abandonan el timo y generan el estanque de células T periféricas. Al igual que cruzar varias fronteras, la célula T cruza varios puestos de control para asegurar la limitación auto-MHC y la auto-tolerancia. [122]

Inicialmente, la mayoría de los investigadores están de acuerdo en que el sistema CD95 no está involucrado en la selección negativa porque el repertorio de TCR en ratones con un defecto en este sistema (lpr, lprcg y gld ratón) no fue alterado [123] [124] .

Pero un examen más detallado constató que la selección negativa puede implicar el sistema CD95 en las células T antígeno en el encuentro de alta concentración [125] . El papel de los demás miembros de la superfamilia de TNF-R, el TNF-R1 y R2-TNF, CD30 y CD40, sigue siendo controvertido. Del mismo modo, las señales de supervivencia de los timocitos en diferentes estadios de maduración siguen estando mal definidas. Numerosos datos indican que los miembros de la supervivencia influencian  la familia Bcl-2 de los linfocitos T inmaduros, es decir, la selección positiva, pero no la selección negativa. [126]

Por último, un papel modulador en la supervivencia de los timocitos y apoptosis se ha atribuido a varias moléculas diferentes, como las hormonas glucocorticoides, citoquinas, que co-estimula los receptores de la superficie celular; moléculas de señalización, factores de transcripción 3 y óxido nítrico [127] . A la vista de los datos disponibles, nuestra comprensión de las bases moleculares de la apoptosis y la selección de los linfocitos T en el timo sigue siendo fragmentaria.

Los linfocitos B-muerte.

Tres moléculas de superficie celular, son elementos clave en la regulación de la vida de las células B y su muerte: célula B receptora (BCR), CD40 y CD95 [128] . La etapa de maduración y activación de los linfocitos B, la cantidad y calidad de la señal proporcionada, y el contexto de las citocinas y otros componentes del ambiente celular son factores clave en la activación del BCR, por ejemplo, antígenos, inducen la supervivencia o la muerte [129] . La evidencia de estudios normales y malignos de las células B sugiere que la activación del BCR induce la apoptosis por la vía mitocondrial. Sin embargo, muchos componentes de la vía de señalización están siendo difíciles de alcanzar. Por tanto, es claro que las señales de enlace BCR estimulan a la activación mitocondrial [130] .

Al igual que en las células T co-estimuladas por CD28, las células B activadas por BCR se pueden rescatar de la apoptosis por la co-estimulación a través de CD40 que se ha activado por CD40L, expresada en las células T y los macrófagos. Este estímulo podría representar la señal más importante de supervivencia para las células B a pesar de que dichas señales en una etapa de maduración diferente también podría preparar las células B de la muerte [131] . Aunque se ha observado que transgénicos bcl-2 previene la muerte y la maduración de afinidad deteriorada en los centros germinales, no está claro, por ejemplo, en qué otras situaciones Bcl-2 y otros miembros de la familia y el inhibidor de la apoptosis-(IAP) bloquea la apoptosis [132] ^, [133] ^, [134] , y en que situaciones IL-4 y otras citoquinas actúan como señales de supervivencia [135] . Además, no está claro cómo las células plasmáticas  con las señales anti-apoptóticas regulan su supervivencia [136] .

Por lo tanto, los principios de las células B y el desarrollo de células T, la selección de repertorio y la participación de la apoptosis en la muerte por la negligencia y la selección negativa son similares. Sin embargo, hay algunas características fundamentales B-específico de las células.

Las células B autorreactivas se eliminan en la médula ósea, pero, en respuesta a la estimulación antigénica, las células B se someten a una diversificación de la segunda y la maduración de afinidad pasa en los centros germinales de los órganos linfoides secundarios mediante un proceso llamado hipermutación somática: baja afinidad o autorreactivas B- mutantes de células son eliminadas por apoptosis y el resto maduran en células B de memoria y células plasmáticas de larga duración. Las células plasmáticas pueden constituir un componente importante de la memoria de células B, en especial las que recirculan a la médula ósea, donde se mantienen viva por las señales de estroma aún por definir. [137] , [138]

Aunque las células T pueden usar CD95L para cometer el suicidio la activación inducida, las células B por lo general no expresan CD95L y mueren de una señal directa de BCR-mediada. Esto abre la posibilidad de que las células T destruyen las células B CD95 positivas. Esto podría aplicarse también a células susceptibles de B o tolerantes a las células B suficientemente estimuladas por señales de supervivencia o cuyos BCR están desocupados por el antígeno [139] .

Recientemente, nuevos pares receptor-ligaduras en TNF-R/TNF han arrojado más luz sobre la regulación de la vida de las células B y la muerte [140] ^, [141] .

BLyS (TALL-1, BAFF, zTNF4) [142] y APRIL se expresan en las células T y células dendríticas, se encontró que se unen a los receptores TACI y BCMA, expresan en las células B desregulación del factor nuclear (NF)-kB [143] , en la proliferación de células B y la inmunoglobulina de producción. Los sistemas de receptor-ligadura parecen actuar en concierto para regular la función de las células B. La sobreestimulación de estos sistemas puede conducir a la autoinmunidad y la formación de auto anticuerpos, como en el lupus eritematoso sistémico. El bloqueo de estos sistemas podría ser utilizado como un nuevo método de tratamiento en estas enfermedades.

Las interacciones entre las APC, células T y células B

Células T y B se influyen entre sí en la persistencia de influencia, la expansión clonal y la apoptosis de otras células. Pero son el primer transporte de tropas las células T, e inician la inmunidad de células T-dependiente [144] . APC son capaces de engullir las células apoptóticas, necróticas y presentar sus antígenos a las células T [145] . Pero no está claro si el material a partir de células apoptóticas o necróticas, activa o suaviza las células T [146] . APC no son células pasivas espectador. Activado APC sintetiza CD95L, TRAIL, TNF y otros factores que modulan la actividad y función de la célula T [147] . A su vez, las células T activadas influyen en la función de APC y con ello afectan el curso de la respuesta inmune. En el inicio de la respuesta inmune, APC debe ser resistente a ejercer su función de apoptosis [148] . Así, la distribución de estas células la respuesta se convierte en una cuestión importante. Dos miembros de la superfamilia de TNF-R, CD40 y CD95, tienen un papel contradictorio en este contexto: el sistema CD40-CD40L permite la supervivencia de las APC y el sistema CD95-CD95L induce su muerte [149] . La plasticidad del sistema inmune puede requerir que las células puedan dar y recibir señales de vida y de muerte al mismo tiempo,  ya que es el contexto celular que determina la señal de respuesta celular.

Los que viven la modernización de una ciudad están familiarizados con la idea de que la construcción de grandes obras viales, implica una cantidad sustancial de demolición de casas. Así también en el desarrollo de los animales: durante la ontogenia de muchos órganos, las células se producen en exceso sólo para el grabado o cortando, para generar las estructuras de la arquitectura de los tejidos funcionales. Después de todo, la mayoría de los animales prosperan en un mar de energía y el libertinaje de las células que los componen, es un precio pequeño a pagar por la capacidad de moverse y propagarse. Es muy poco probable que el pavo real, al encontrar la pava de sus sueños, objete a ponderar el costo energético de su cola flamente.

Ahora está claro que la muerte celular fisiológica, es un componente esencial del desarrollo animal, importante para el establecimiento de órganos y el mantenimiento de la arquitectura del tejido. Un modus operandi general de desarrollo metazoos es el sobre-exceso de producción de células, seguido de una matanza selectiva de apoptosis en las etapas posteriores del desarrollo para que coincida con el número relativo de células de diferentes tipos para lograr un adecuado órgano funcional [150] . Así, durante el desarrollo de los animales, se forman numerosas estructuras que luego son eliminadas por apoptosis. Esto permite una mayor flexibilidad en las estructuras primordiales, pueden ser adaptadas para diferentes funciones en las distintas etapas de la vida o para diferentes sexos. Por lo tanto, el conducto de Müllerrian da lugar a la existencia del útero y el oviducto en las hembras, pero no es necesaria en los hombres y así, en consecuencia, es eliminado por apoptosis. Por otro lado, el conducto de Wolffian es la fuente de los órganos reproductores masculinos y se elimina en las mujeres por apoptosis. Los organismos son como muchos programas de computadora moderna, llenos de código remanente que alguna vez se utilizó en una encarnación ancestral o que se ejecuta en rutinas irrelevantes que nadie necesita. Durante el desarrollo, la apoptosis se utiliza frecuentemente para borrar estas estructuras. Por ejemplo, a principios del desarrollo de los vertebrados, los túbulos pronéfricos renales surgen del mesénquima renal. A pesar de estos túbulos pronéfricos, se forman riñones funcionales en los peces y en las larvas de anfibios, y no se activan en los mamíferos [151] . Del mismo modo ocurre, durante la metamorfosis de insectos y anfibios, la apoptosis de ablación, hace que las células que ya no son necesarias tales como los músculos y las neuronas esenciales para la locomoción de larvas de insectos o la cola de renacuajo anfibio se pierdan.

La apoptosis también actúa en el marco de un control de calidad y un mecanismo de reparación que contribuye al alto nivel de plasticidad durante el desarrollo mediante la compensación de muchos errores en el desarrollo genético estocásticos. Por ejemplo, los embriones de la Drosophila con dosis extra de la morfogen bicoide (BCD) de genes, muestran malformaciones severas en sus regiones anteriores. Sorprendentemente, estos embriones se convierten en larvas y adultos relativamente normales, porque la muerte celular compensa el crecimiento excesivo de tejidos [152] . Las células que no hayan sido correctamente programados son, en efecto, las células fuera de lugar, por lo tanto, no reciben las señales adecuadas para su supervivencia trófica y activa, en consecuencia, sus mecanismos innatos de auto-destrucción no están presentes.

La primera evidencia de una base genética de la apoptosis vino de los estudios en C. elegans cuyo invariante es el linaje restringido en el desarrollo, que lo hace un organismo con la ventaja especial para el estudio de los procesos de desarrollo. Durante la ontogenia del gusano hermafrodita adulto, de 131 de las 1,090 células somáticas que mueren por apoptosis, dejan a un adulto con 959 células. Los genéticos observaron en los mutantes defectuosos en la muerte celular, la identificación de los genes específicos necesarios para la regulación, ejecución y resolución de la apoptosis, de los cuales cuatro son, EGL-1, ced-3, ced-4 y ced-9, que se requieren para cada muerte celular. La pérdida de función por mutaciones en EGL-1; ced-3 o ced-4 es clave en la supervivencia de las 131 células condenadas, implican a estos tres genes en la inducción de muerte celular. Por el contrario, los animales que carecen de ced-9 mueren tempranamente en el desarrollo debido a la muerte masiva de células ectópicas, mientras que una mutación de ganancia de función en ced-9 bloquea todas las muertes de las 131 células, implicando ced-9 como un supresor de la muerte celular. [153]

Cabe destacar que este mecanismo de muerte celular básica es altamente conservado durante la evolución de metazoos. ced-3 codifica a CED-3, una proteasa de cisteína de una clase conservada evolutivamente, ahora apodada  "caspasas" debido a su predilección por hendidura en los residuos aspartil. Por su propia división crítica de sustratos celulares, las caspasas actúan como motores clave de la destrucción celular en todos los metazoos¹⁰. Como la mayoría de las proteasas, las caspasas se sintetizan como zimógenos pro-enzima que tienen poca o ninguna actividad catalítica intrínseca. Son activados por escisión proteolítica, sea a través de la acción de las caspasas o a través de un proceso autocatalítico en el que las moléculas de procaspasa múltiples son muy próximas a través de la formación del complejo multiproteico "apoptosoma" [154] . Estos complejos permiten la baja actividad proteolítica intrínseca de las procaspasas para activar su propia división intermolecular y la activación. Además de CED-3, otras dos caspasas se identificaron en C. elegans, CSP-1 y DEN-2 [155] . Sin embargo, la falta de muerte celular en mutantes ced-3 indica que no pueden reemplazar la función CED-3 y es probable que ambos actúen como parte de una cascada proteolítica baja.

Las caspasas se pueden agrupar en dos tipos generales basadas en el tamaño de sus prodominios amino-terminal. Las caspasas con prodomineos cortos (tipo 2), en general, activadas por caspasa en división y actúen como "efectores" que aplican la apoptosis mediante fragmentación de los sustratos adecuados. En cambio, el prodominio extendido del tipo de los llamados caspasas 1 'iniciador', de los cuales CED-3 es un ejemplo, sirven como dominios de la interacción para el montaje en el complejo apoptosoma, un conjunto que depende de adaptador específico o andamios moléculares y por lo general se produce en respuesta a la activación de algunas vías de señalización pro-apoptótica. En C. elegans, la proteína adaptadora requisito es codificada por ced-4, aunque su capacidad innata para desencadenar la activación de CED-3 es restañando el producto proteico del gen ced-9 de la muerte del supresor. Sólo cuando CED-4 se desplaza de CED-9 por la proteína EGL-1 es la acción letal proteolítica de CED-3, desatado para la ablación de sus 131 víctimas celulares. La evidencia indica que EGL-1 puede ser regulada transcripcionalmente. Por ejemplo, la expresión EGL-1 induce la apoptosis en las neuronas hermafroditas específicas de gusanos machos, mientras que su expresión en las hermafroditas es reprimida por el factor de determinación de transcripción de sexo TRA-1A [156] . A pesar de EGL-1 y las proteínas CED que están implicadas en las muertes de células de desarrollo en C. elegans, no todas las muertes celulares se regulan de la misma manera. Por ejemplo, CES-1 y CES 2-Ley para regular la apoptosis en neuronas específicas. CES-1 es un anti-apoptótico de Snail/Slug represor transcripcional del caracol [157] cuyos destinatarios son los genes apoptóticos [158] . CES-2 es una proteína bZip PAS, relacionada con el factor de la leucemia en mamíferos [159] , que actúa para promover la apoptosis a través de la represión de la expresión de CES-1 [160] . Otro ejemplo de células de tipo específico es la muerte de las células germinales en la gónada hermafrodita, que utiliza CED-3, CED-4 y CED 9-pero es independiente de EGL-1. Este ejemplo de la apoptosis de nemátodos también es interesante porque no es pre-programado, pero se produce de una forma de adaptación en respuesta al daño del ADN, la edad y los factores ambientales y es modulada por el Ras/ proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) [161] .

La interacción mecánica general de los mecanismos de muerte celular C. elegans se conserva, aunque con cambios sustanciales, en otros metazoos. Múltiples caspasas están presentes tanto en la Drosophila y mamíferos, y estos a su vez son regulados por varios homólogos y análogos de la CED-4 adaptador / proteína de andamiaje de los cuales el más cercano evolutivamente conocido son funcionales de Apaf-1 en hombres [162] y dApaf-1/DARK/HAC-1 en las moscas [163] ^, [164] . Además, en los mamíferos por lo menos, algunas caspasas se activan mediante el reclutamiento en los complejos inducidos por la ligadura de los receptores de muerte como CD95 (Apo-1/Fas) y el factor de necrosis tumoral (TNF) del receptor 1 [165] . Expresión del gen humano BCL -2 en el nemátodo C. elegans redujo el número de programado de muertes celulares, sugiriendo que el mecanismo de programación de la muerte celular controlada por bcl -2 en humanos es la misma que en los nemátodos [166] .

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Biología de sistemas:  una mirada a lo más  profundo de nuestro origen, evolución y funcionamiento.  Copyright © 2003-2010 por la ANUIES/SINED/UMSNH. CIE Tzintzuntzán No. 173, Col. Matamoros C.P. 58240, Edificio E Planta alta, Morelia Michoacán, México. Tel/fax: 3-14-28-09

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Ochoa, H. E., et al (2010) Biología de sistemas. Una mirada a lo más  profundo de nuestro origen, evolución y funcionamiento. México, ANUIES/SINED/UMSNH. vii, 302 p.; carta

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